色譜技術簡介
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引 言
色譜法是1906年俄國植物學家Michael Tswett將含有有色的植物葉子色素和溶液通過裝填有白堊粒子吸附劑的柱子，企圖分離它們時而發現并命名的。各種色素以不同的速率通過柱子，從而彼此分開。分離開的色素形成不同的色帶而易于區分，由此得名為色譜法（Chromatography），又稱層析法。其后的一個重大進展是1941年Martin和Synge 發現了液－液（分配）色譜法[Liquid-Lipuid（partition）Chromatography，簡稱LIC]。 他們用覆蓋于吸附劑表面的并與流動相不混溶的固定液來代替以前僅有的固體吸附劑。試樣組分按照其溶解在兩相之間分配。Martin和Synge因為這一工作而榮獲1952 年諾貝爾化學獎。在使用柱色譜的早期年代，可靠地鑒定小量的被分離物質是困難的，所以研究發展了紙色譜法（Paper Chromatography，簡稱PC）。在這種“平面的”技術中，分離主要是通過濾紙上的分配來實現的。然后由于充分考慮了平面色譜法的優點而發展了薄層色譜法（Thin-Layer Chromatography，簡稱TLC），在這種方法中，分離系在涂布于玻璃板或某些堅硬材料上的薄層吸附劑上進行。 在Stah－l于1958年進行了經典性的工作將技術和所用材料加以標準化之后， 薄層色譜法方贏得了聲譽。為了幫助提高紙色譜法或薄層色譜法對離子化合物的分離效率，可以向紙或板施加電場。這種改進了方法分別稱作紙上電泳或薄層電泳。 新近發展起來的色譜法 氣相色譜法是Martin和James于1952 年首先描述的，現已成為所有色譜法中最高級和最廣泛使用的一種方法，它特別適用于氣體混合物或揮發性液體和固體，即便對于很復雜的混合物，其分離時間也僅為幾分鐘左右，這已屬司空見慣。高分辯率、分析迅速和檢測靈敏等幾種優點之綜合使氣相色譜法成了幾乎每個化學實驗室要采用的一種常規方法。近年來，因為新型液相色譜儀和新型柱填料的發展以及對色譜理論的更深入了解，又重新引起對密閉柱液相色譜法的興趣。高效液相色譜法（High-Performance Liquid Chromatography，簡稱HPLC）迅速成為與氣相色譜法一樣廣泛使用的方法，對于迅速分離非揮發性的或熱不穩定的試樣來說，高效液相色譜法常常是更可取的。 色譜法分類 色譜法有多種類型，也有多種分類方法。 （一）按兩相所處的狀態分類 液體作為流動相，稱為“液相色譜”（liquid chromatograp-hy）；用氣體作為流動相，稱為“氣相色譜”（gas chromatogr-aphy）。固定相也有兩種狀態，以固體吸附劑作為固定相和以附載在固體上的液體作為固定相，所以層析法按兩相所處的狀態可以分為： 液－固色譜（liquid-solid chromatography） 液－液色譜（liquid-liquid chromatography） 氣－固色譜（gas-solid chromatography） 氣－液色譜（gas-liquid chromatography） （二）按層析過程的機理分類 吸附層析（adsorption chromatography ）利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異，達到分離鑒定的目的。 分配層析（partition chromatography）利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數（或溶解度）不同，而使之分離的方法。 離子交換層析（ion-exchange chromatography ）利用不同組分對離子交換劑親和力的不同，而進行分離的方法。凝膠層析（gelchromatography）利用某些凝膠對于不同組分因分子大小不同而阻滯作用不同的差異，進行分離的技術。 （三）按操作形式不同分類 柱層析（colum chromatography）將固定相裝于柱內，使樣品沿一個方向移動而達到分離。紙層析（paper chrmatography）用濾紙作液體的載體（擔體support），點樣后，用流動相展開，以達到分離鑒定的目的。薄層層析（thin layper chromatography）將適當粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進行物質的分離和鑒定。 吸附色譜法 吸附色譜法常叫做液－固色譜法（Liquid-Solid Chromatography，簡稱LSC），它是基于在溶質和用作固定固體吸附劑上的固定活性位點之間的相互作用?？梢詫⑽絼┭b填于柱中、覆蓋于板上、或浸漬于多孔濾紙中。吸附劑是具有大表面積的活性多孔固體，例如硅膠、氧化鋁和活性炭等?；钚渣c位例如硅膠的表面硅烷醇，一般與待分離化合物的極性官能團相互作用。分子的非極性部分（例如烴）對分離只有較小影響，所以液－固色譜法十分適于分離不同種類的化合物（例如，分離醇類與芳香烴）。 分配色譜法 在分配色譜法（也稱體液－液色譜法）中，溶質分子在兩種不相混溶的液相即固定相和流動相之間按照它們的相對溶解度進行分配。固定相均勻地覆蓋于惰性載體─多孔的或非多孔的固體細?；蚨嗫准埳希埳献V）。為避免兩相的混合，兩種分配液體在極性上必須顯著不同。若固定液是極性的（例如乙二醇），流動相是非極性的（例如乙烷），那么極性組分將較強烈的被保留。這是通常的操作方式。另一方面，若固定相是非極性的（例如癸烷），流動相是極性的（例如水），則極性組分易分配于流動相，從而洗脫得較快。后一種方法（它有相反的極性）稱作為反相液─液色譜法。由于溶解度差別的細微效應，所以液─液色譜法很適于分離同系物的同分異構體。在液─液色譜法中，固定相幾乎都被化學鍵合在載體物質上，而不是機械覆蓋在它的表面。這種色譜法稱作鍵合相色譜法（Bonded-Phase Chromatography，簡稱 BPC）。這種方法的機理尚不清楚，可能是分配機理，也可能是吸附機理， 視實驗條件而定。高效液相色譜法中，鍵合相色譜法的應用遠遠超過所有其他模式。 離子交換色譜法 Sober 和 Peterson于1956年首次將離子交換基團結合到纖維素上，制成了離子交換纖維素，成功地應用于蛋白質的分離。從此使生物大分子的分級分離方法取得了迅速的發展。離子交換基團不但可結合到纖維上， 還可結合到交聯葡聚糖（S-ephadex）和瓊脂糖凝膠（Sepharose）上。 近年來離子交換色譜技術已經廣泛應用于蛋白質、酶、核酸、肽、寡核苷酸、病毒、噬菌體和多糖的分離和純化。它們的優點是:⑴具有開放性支持骨架，大分子可以自由進入和迅速擴散，故吸附容量大。⑵具有親水性，對大分子的吸附不大牢固，用溫和條件使可以洗脫，不致引起蛋白質變性或酶的失活。⑶多孔性，表面積大、交換容量大，回收率高，可用于分離和制備。 一、基本理論 離子交換劑通常是一種不溶性高分子化合物，如樹脂，纖維素，葡聚糖，醇脂糖等，它的分子中含有可解離的基團，這些基因在水溶液中能與溶液中的其它陽離子或陰離子起交換作用。雖然交換反應都是平衡反應，但在層析柱上進行時，由于連續添加新的交換溶液，平衡不斷按正方向進行，直至完全。因此可以把離子交換劑上的原子離子全部洗脫下來，同理，當一定量的溶液通過交換柱時，由于溶液中的離子不斷被交換而波度逐減少，因此也可以全部被交換并吸附在樹脂上。如果有兩種以上的成分被交換吸著在離子交換劑上，用洗脫液洗脫時，在被洗脫的能力則決定于各自洗反應的平衡常數。蛋白質的離子交換過程有兩個階段──吸附和解吸附。吸附在離子交換劑上的蛋白質可以通過改變pH使吸附的蛋白質失去電荷而達到解離但更多的是通過增加離子強度，使加入的離子與蛋白質競爭離子交換劑上的電荷位置，使吸附的蛋白質與離子交換劑解開。不同蛋白質與離子交換劑之間形成電鍵數目不同，即親和力大小有差異 ，因此只要選擇適當的洗脫條件便可將混合物中的組分逐個洗脫下來，達到分離純化的目的。 二、離子交換的分類及常見種類 （一）分類 離子交換劑分為兩大類，即陽離子交換劑和陰離子交換劑。各類交換劑根據其解離性大小，還可分為強、弱兩種，即 強酸劑 陽離子交換劑 弱酸劑 強鹼型 陰離子交換劑 弱鹼型 。 1.陽離子交換劑 陽離子交換劑中的可解離基因是磺酸（-SO3H）、磷酸（-PO3H2）、 羧酸（COOH）和酚羥基（-OH）等酸性基。 某些交換劑在交換時反應如下： 強酸性：R-SO3 -H+ ＋ Na+ R-SO3- Na+H+ 弱酸性：R-COOH＋Na+ R-COONa ＋H+ 國產樹脂中強酸1×7（上海樹脂＃732）和國外產品Dowex 50、Zerolit 225等都于強酸型離子交換劑。 2.陰離子交換劑 陰離子交換劑中的可解離基因是伯胺、（-NH2）、仲胺（-NHCH3）、叔胺[N-（CH3）2]和季胺[-N（CH3）2]等鹼性基團。某些交換反應如下： 強鹼性：R-N+（CH3）2 H·OH- ＋Cl R-N+（CH3）2 Cl＋OH- 弱鹼性：R-N+（CH3）2 H·OH- ＋Cl R-N+（CH3）2 HCl＋OH- 強鹼性＃201號國產樹脂和國外Dowex1、Dowex2、ZerolitFF等都屬于強鹼型陰離子交換劑。 （二）種類 1.纖維素離子交換劑：陽離子交換劑有羥甲基纖維素（CM-纖維素）， 陰離子交換劑有氯代三乙胺纖維紗（DESE-纖維素）。 2.交聯葡聚糖離子交換劑：是將交換基因連接到交聯葡聚糖上制成的一類交換劑，因而既具有離子交換作用，又具有分子篩效應，是一類廣泛應用的色譜分離物質。常用的Sephadex離子交換劑也有陰離子和陽離子交換劑兩類。陰離子交換劑有DEAE-Sephadex A-25，A-50和QAE- Sephadex A25 ， A50 ； 陽離子交換劑有CM-Sephaetx C-50，C-50和Sephadex C-25，C-50。陰離子交換劑用英文字頭A，陽離子交換劑的英文字頭是C。英文字后面的數字表示Sephadex型號。 3.瓊脂糖離子離交換劑：是將DESE-或CM-基團附著在Sepharose CL-6B 上形成，DEAE-Sephades（陰離子）和CM-Sepharose（陽離子），具有硬度大， 性質穩定，凝膠后的流速好，分離能力強等優點。 三、實驗操作 （一）交換劑的處理，再生與轉型 新出廠的樹脂是干樹脂，要用水浸透使之充分吸水膨脹。因其含有政績一些雜質，所要要用水、酸、鹼洗滌。一般手續如下：新出廠干樹脂用水浸泡2 小時后減抽壓去氣泡，傾去水，再用大量無離子水洗至澄清，去水后加4倍量2N HCl攪抖4小時，除去酸液，水洗到中性，再加4倍量2N NaOH攪抖4小時，除鹼液， 水洗到中性備用。將樹脂帶上所希望的某種離子的操作稱為轉型。如希望陽樹脂帶Na+，則用4倍量NaOH攪拌浸泡2小時以上；如希望樹脂帶H+，可用HCl處理。陰樹脂轉型也同樣，若希望帶Cl-則用HCl，希望帶OH-則用NaOH。用過的樹脂使其恢復原狀的方法稱為再生。并非每次再一都用酸、鹼液洗滌，往往只要轉型處理就行了。 （二）柱上操作 ⑴交換劑裝柱最簡單的交換層析柱可用鹼式滴定管代替。處理過的樹脂放入燒杯，加少量水邊攪拌邊倒入保持垂直的層析管中，使樹脂緩慢沉降。交換劑在柱內必須分布均勻。 ⑵上樣向層析柱內傾入樣品液 ⑶洗脫與收集 不同樣品選用的洗脫液不同。原則是用一種比吸著物質更活潑的離子，把吸著物交換出來。由于被吸著的物質往往不是我們所要求的單一物質，因此除了正確選擇洗脫液外還采控制流速和分布收集的方法來獲得所需的單一物質。 膠色譜法 凝膠色譜技術是六十年代初發展起來的一種快速而又簡單的分離分技術，由于設備簡單、操作方便，不需要有機溶劑，對高分子物質有很高的分離效果。目前已經被生物化學、分子生物學、生物工程學、分子免疫學以及醫學等有關領域廣泛采用，不但應用于科學實驗研究，而且已經大規模地用于工業生產。 一、基本理論 （一）分子篩效益 一個含有各種分子的樣品溶液緩慢地流經凝膠色譜柱時，各分子在柱內同時進行著兩種不同的運動：垂直向下的移動和無定向的擴散運動。大分子物質由于直徑較大，不易進入凝膠顆粒的微孔，而只能分布顆粒之間，所以在洗脫時向下移動的速度較快。小分子物質除了可在凝膠顆粒間隙中擴散外，還可以進入凝膠顆粒的微孔中，即進入凝膠相內，在向下移動的過程中，從一個凝膠內擴散到顆粒間隙后再進入另一凝膠顆粒，如此不斷地進入和擴散，小分子物質的下移速度落后于大分子物質，從而使樣品中分子大的先流出色譜柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，這種現象叫分子篩效應。具有多孔的凝膠就是分子篩。各種分子篩的孔隙大小分布有一定范圍，有最大極限和最小極限。分子直徑比凝膠最大孔隙直徑大的，就會全部被排阻在凝膠顆粒之外，這種情況叫全排阻。兩種全排阻的分子即使大小不同，也不能有分離效果。直徑比凝膠最小孔直徑小的分子能進入凝膠的全部孔隙。如果兩種分子都能全部進入凝膠孔隙，即使它們的大小有差別，也不會有好的分離效果。因此，一定的分子篩有它一定的使用范圍。綜上所述，在凝膠色譜中會有三種情況，一是分子很小，能進入分子篩全部的內孔隙；二是分子很大，完全不能進入凝膠的任何內孔隙；三是分子大小適中，能進入凝膠的內孔隙中孔徑大小相應的部分。大、中、小三類分子彼此間較易分開，但每種凝膠分離范圍之外的分子，在不改變凝膠種類的情況下是很難分離的。對于分子大小不同，但同屬于凝膠分離范圍內各種分子，在凝膠床中的分布情況是不同的：分子較大的只能進入孔徑較大的那一部分凝膠孔隙內，而分子的可進入較多的凝膠顆粒內，這樣分子較大的在凝膠床內移動距離較短，分子較小的移動距離較長。于是分子較大的先通過凝膠床而分子較小的后通過凝膠床，這樣就利用分子篩可將分子量不同的物質分離。另外，凝膠本身具有三維網狀結構，大的分子在通過這種網狀結構上的孔隙時阻力較大，小分子通過時阻力較小。分子量大小不同的多種成份在通過凝膠床時，按照分子量大小“排隊，凝膠表現分子篩效應。 （二）色譜柱的重要參數 ⑴柱體積：柱體積是指凝膠裝柱后，從柱的底板到凝膠沉積表面的體積。在色譜柱中充滿凝膠的部分稱為凝膠床，因引柱體積又稱“床”體積，常用Vt 表示。 ⑵外水體積：色譜柱內凝膠顆粒間隙，這部分體積稱外水體積，亦稱間隙體積，常用Vo表示。 ⑶內水體積：因為凝膠為三維網狀結構，顆粒內部仍有空間，液體可進入顆粒內部，這就分間隙的總和為內水體積，又稱定相體積，常用Vi表示。 不包括固體支持物的體積（Vg）。 ⑷峰洗脫體積：是指被分離物質通過凝膠柱所需洗脫液有體積，常用Ve 表示。當使用樣品的體積很少時，（與洗脫體積比較可以忽略不計），在洗脫圖中，從加樣到峰頂位置所用洗脫液體積為Ve。 當樣品體積與洗脫體積比較不能忽略時，洗脫體積計算可以從樣品體積的一半到峰頂位置。當樣品很大時，洗脫體積計算可以從應用樣品開始到洗脫峰升高的彎曲點（或半高處）。 二、凝膠的種類及性質 （一）交聯葡聚糖凝膠（Sephadex） ⑴Sephadex G交聯葡聚糖的商品名為Sephndex，不同規格型號的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯數為凝膠得水值的10倍。例如，G-25為每克凝膠膨脹時吸水2.5克，同樣G-200克每克千膠吸水20克。交聯葡聚糖凝膠的種類有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映，凝膠的交聯程度，膨脹程度及分部范圍。 ⑵Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物， 能溶于水及親脂溶劑，用于分離不溶于水的物質。 （二）瓊脂糖凝膠： 商品名很多，常見的有，Sepharose（瑞典，pharmacia ），Bio-Gel-A（美國Bio-Rad）等。瓊脂糖凝膠是依靠糖鏈之間的次級鏈如氫鍵來維持網狀結構，網狀結構的疏密依靠瓊脂糖的濃度。一般情況下，它的結構是穩定的，可以在許多條件下使用（如水，pH4-9范圍內的鹽溶液）。瓊脂糖凝膠在40℃以上開始融化，也不能高壓消毒，可用化學滅菌活處理。 （三）聚丙烯酰胺凝膠： 是一種人工合成凝膠，是以丙烯酰胺為單位， 由甲叉雙丙烯酰胺交聯成的，經干燥粉碎或加工成形制成粒狀，控制交聯劑的用量可制成各種型號的凝膠。交聯劑越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠－P （Bio-Gel P），由美國Bio-Rod廠生產，型號很多，從P-2至P-300共10種，P 后面的數字再乘1000就相當于該凝膠的排阻限度。 （四）聚苯乙烯凝膠商品為Styrogel ， 具有大網孔結構， 可用于分離分子量1600到40，000，000的生物大分子，適用于有機多聚物，分子量測定和脂溶性天然物的分級，凝膠機械強度好，洗脫劑可用甲基亞砜。 三、實驗技術 （一）層析柱 層析柱是凝膠層析技術中的主體，一般用玻璃管或有機玻璃管。層析柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大，可加大柱的直徑，一般制備用凝膠柱，直徑大于2厘米，但在加樣時應將樣品均勻分布于凝膠柱床面上。此外， 直徑加大，洗脫液體體積增大，樣品稀釋度大。分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱床必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關，但由于軟凝膠柱過高擠壓變形阻塞，一般不超過1米。分族分離時用短柱，一般凝膠柱長20-30厘米，柱高與直徑的比較5:1─10:1，凝膠床體積為樣品溶液體積的4-10倍。 分級分離時柱高與直徑之線為20:1─100:1，常用凝膠柱有50×25厘米，10×25厘米。層析柱濾板下的死體積應盡可能的小，如果支掌濾板下的死體積大，被分離組分之間重新混合的可能性就大，其結果是影響洗脫峰形，出現拖尾出象，降低分辯力。在精確分離時，死體積不能超過總床體積的1/1000。 （二）凝膠的選擇 根據所需凝膠體積，估計所需干膠的量。 一般葡聚糖凝膠吸水后的凝膠體積約為其吸水量的2倍，例如Sephadex G-20的吸水量為20，1 克Sephadex G─200吸水后形成的凝膠體積約40ml。凝膠的粒度也可影響層析分離效果。粒度細胞分離效果好，但阻力大，流速慢。一般實驗室分離蛋白質采用100-200號篩目的的Sephadex G-200效果好， 脫鹽用Sephadex G-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。 （三）凝膠的制備 商品凝膠是干燥的顆粒使用前需直接在欲使用的洗脫液中膨脹。為了加速膨脹，可用加熱法，即在沸水浴中將濕凝膠逐漸升溫至近沸，這樣可大大中速膨脹，通常在1-2小時內即可完成。特別是在使用軟膠時， 自然膨脹需24小時至數天，而用加熱法在幾小時內就可完成。這種方法不但節約時間，而且還可消毒，除去凝膠中污染的細菌和排除膠內的空氣。 （四）樣品溶液的處理 樣品溶液如有沉淀應過濾或離心除去，如含脂類可高速離心或通過Sephadex G-15短柱除去。樣品的粘度不可大，含蛋白為超過4％，粘度高影響分離效果。上柱樣品液的體積根據凝膠床體積的分離要求確定。分離蛋白質樣品的體積為凝膠床的1-4％（一般約0.5-2ml），進行分族分離時樣品液可為凝膠床的10％，在蛋白質溶液除鹽時，樣品可達凝膠床的20-30％。 分級分離樣品體積要小，使樣品層盡可能窄，洗脫出的峰形較好。 （五）防止微生物的污染 交聯葡聚糖和瓊脂糖都是多糖類物質，防止微生物的生長，在凝膠層析中十分重要，常用的抑菌劑有: ⑴疊氨鈉（NaN3）在凝膠層析中只要用0.02％疊氮鈉已足夠防止微生物的生長，疊氮鈉易溶一水，在20℃時約為40％；它不與蛋白質或碳水化合物相互作用，因此疊氮鈉不影響抗體活力；不會改變蛋白質和碳水化合物的層析我特性。疊氮鈉可干擾熒光標記蛋白質。 ⑵可樂酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2]在凝膠層析中使用濃度為0.01-0.02％。在微酸性溶液中它的殺菌效果最佳，在強堿性溶液中或溫度高于60℃時易引起分解而失效。 ⑶乙基汞代巰基水楊酸鈉 在凝膠層析中作為抑菌劑使用濃度為0.05-0. 01％。在微酸性溶液中最為有效。重金屬離子可使乙基代巰基的物質結合，因而包含疏基的蛋白質可在不同程度上降低它的抑菌效果。 ⑷苯基汞代鹽 在凝膠層析中使用濃度為0.001-0.01％。在微堿性溶液中抑效果最佳，長時間放置時可與鹵素、硝酸根離子作用而產生沉淀；還原劑可引起此化合物分解；含疏基的物質亦可降低或抑制它的抑菌作用。 親和色譜法 一、基本理論 （一）原理 在生物體內，許多大分子AKSJDHFKLSDFHKLSDJ具有與某些相對應的專一分子可逆結合的特性。例如抗原和抗體、酶和底物及輔酶、激素和受體、RNA和其互補的DNA等，都具有這種特性。生物分子之間這種特異的結合能力稱為親和力，根據生物分子間親和吸附和解離的原理，建立起來的色譜法稱親色譜法。親和色譜中兩個進行專一結合的分子互稱對方為配基。如抗原和抗體，抗原可認為是抗體的配基，反之抗體也可認為是抗原的配基。將一個水溶性配基在不傷害其生物學功能的情況下與水不溶性載體結合稱為配基的固相化。親和色譜法的基本過程是： 1.配基固相化。將與純化對象有專一結合作用的物質，連接在水不溶性載體上，制成親和吸附劑后裝柱（稱親和性）。 2.親和吸附。將含有純化對象的混合物通過親和柱，純化對象吸附在柱上，其他物質流出色譜柱。 3.解吸附。用某種緩沖液或溶液通過親和柱，把吸附在親和柱上的欲純化物質洗脫出來。 （二）應用范圍 親和色譜可用于下列生物體系： 酶：底物、抑制劑、輔酶 抗體：抗原、病毒、細胞 外源凝集素：多糖、糖蛋白、細胞表面受體、 細胞核酸：互補堿基序列、組蛋白、核酸聚合酶 、結合蛋白 激素及維生素：受體、載體蛋白 細胞：細胞表面特異蛋白、外源凝集素 親和色譜的優點是操作簡便、效率高、條件溫和，缺點是使用局限性大。 （三）載體的選擇原則 用于親和色譜的理想載體應具有下列特性：⑴不溶性：不溶于水；⑵滲透性：疏松網狀結構，容許大分子自由通過；⑶有一定硬度，最好為均一的珠狀；⑷具有大量可供反應的化學基團，能與大量配基共價連接；⑸非特異性吸附能力極低；⑹能抗微生物和酶的侵蝕；⑺有較好的化學穩定性；⑻親水性。選擇配基根據對純化大分子的特異性的全面認識。 選擇也的配基有兩條標準： 第一是蛋白質和配基之間必須有強的親和力，解離常數在5mM以上不是好配基； 相反親和力太高也是有害的，因為在解離蛋白質──配基復合物時所需的條件就要強烈，這樣可能使蛋白質變性。例如用抗生物素蛋白作配基純化含生物素的羧化酶時，生物素──抗生物素蛋白復合物的解離常數達10-15M，解離時需要pH1.5，6M鹽酸胍，在這種條件中。羧化酶大多數已經變性。 選擇配基的第二個標準是，配基必須具有適當的化學基團，這種基團不參與配基與蛋白質之間特異結合，但可用于活化和載體相連接，同時又不影響配基與蛋白質之間的親和力。 （四）常見載體的特性 瓊脂糖凝膠： 親水性強，理化性質穩定 （商品名：Sepharose） 聚丙烯酰胺凝膠： 理化性質穩定，耐有機溶劑及去污劑， 抗微生物能力強， 特別適應用配基與提取物親和力比較弱的物質。 葡聚糖凝膠： 有良好的化學及物理性質，孔經小。 纖維素： 非特易吸附嚴重，廉價，易得。 二、實驗方法 親和色譜分離的方法隨每種分離物質的不同而有不同。一般推薦使用的程序如下： 1選 擇 配 基；2選擇偶聯凝膠；3偶 聯 配 基；4裝填合適的柱；5平衡（2-3倍體積緩沖液）；6應 用 樣 品；7洗滌未結合物質；8洗脫結合物質→除鹽；9再生 高壓液相色譜 Martin 和 Synge在1941年就提出高效相色譜的設想，然而直到六十年代后期，由于各種技術的發展，高效液相色譜才付諸實現。這種色譜技術曾被稱為高速液相色譜（HighSpeed Liquid Chromatography），高壓液相色譜（High Parss-ure Lipuid Chromatography），目前使用最多的名稱是高效液相色譜（High Pe-rformance Liauid Chromatography，HPLC）。高效液相色譜已經廣泛地應用，成為一項不可缺少的技術。它的主要優點是⑴分辯率高于其它色譜法；⑵速度快，十幾分鐘到幾十分鐘可完成；⑶重復性高；⑷高效相色譜柱可反復使用；⑸自動化操作，分析精確度高。根據分離過程中溶質分子與固定相相互作用的差別，高效液相色譜可分為四個基本類型，即液－固色譜、液－液色譜、離子交換色譜和體積排阻色譜。高效液相色譜在生物領域中廣泛用于下列產物的分離和鑒定：⑴氨基酸及其衍生物；⑵有機酸；⑶甾體化合物；⑷生物鹼；⑸抗菌素；⑹糖類；⑺卟啉；⑻核酸及其降解產物；⑼蛋白質、酶和多肽；⑽脂 一、分類 高效液相色譜法可分為四個基本類型：即液－固色譜法，鍵合相色譜法，離子交換色譜法及體積排阻色譜法。 （一）液－固色譜法 液－固色譜法通常稱吸附色譜法，吸附劑有活性碳，氧化鋁和硅膠，在液－固色譜法中用的載體都是硅膠。硅膠對溶質，分子的吸附能力不是平均分布在整個硅脫表面的，在硅膠表面有一些區域與溶質分子強烈相互作用，這些區域為活性位置，硅膠與溶質分子間主要作用是偶極距力氫鍵及靜電相互作用。極性越強，而化合物在硅膠柱上的滯留時間也長。在液－固色譜中，依靠流動相溶劑分子與溶質分子競爭固定相互活性位置， 從而使溶質從色譜柱上洗脫下來。與硅膠表面活性位置結合力強的溶劑洗脫溶質分子的能力強，因而稱強溶劑，反之為弱溶劑。液─固色譜法的特點是適于分離色譜幾何異構體，可用于脂溶性化合物質如磷脂，甾體化合物，脂溶性維生素，前列腺素等。 （二）鍵合相色譜法 鍵合相色譜法是由液－液色譜法即分配色譜發展起來的。鍵合相色譜法將固定相共價結合在載體顆粒上，克服了分配色譜中由于固定相在流動中有微量溶解，及流動相通過色譜柱時的機械沖擊，固定相不斷損失，色譜柱的性質逐漸改變等缺點。鍵合相色譜法可分為正常相色譜法和反相色譜法。 1.正常相色譜法 在正常相色譜法中共價結合到載體上的基團都是極性基團，如一級氨基、氰基、二醇基、二甲氨基和二氨基等。流動相溶劑是與吸附色譜中的流動相很相似的非極性溶劑，如庚烷、已烷及異辛烷等。由于固定相是極性，因此流動溶劑的極性越強，洗脫能力也越強，即極性大的溶劑是強溶劑。固定相與流動相的這種關系正好與液－固色譜法相同，稱這種色譜法為正常相色譜法。盡管如此，正常相色譜法的分離原理主要根據化合物在固定相及流動相中分配系數的不同進行分離，它不適于分離幾何異構體。 2.反相色譜法 在反相色譜法中共價結合到載體上的固定相是一些直鏈碳氫化合物，如正辛基等。流動相的極性比固定相的極性強。反相色譜法在高效液相色譜法中應用最廣泛。 在反相色譜法中，使溶質滯留的主要作用是疏水作用，在高效液相色譜中又被稱為疏溶劑作用。所謂疏水作用即當水中存在非極性溶質時，溶質分子之間的相互作用 、溶質分子與水分子之間的相互作用遠小于水分子之間的相互作用， 因此溶質分子從水中被“擠”了出去?？梢姺聪嗌V中疏水性越強的化合物越容易從流動相中擠出去，在色譜柱中滯留時間也長，所以反相色譜法中不同的化合物根據它們的疏水特性得到分離。反相色譜法適于分離帶有不同疏水基團的化合物，亦即非極性基團的化合物。此外，反相色譜法可用于分離帶有不同極性基團的化合物?？梢酝ㄟ^改變流動相的溶劑及其組成和pH，以影響溶質分子與流動相的相互作用，改變它們的滯留行為。另外，反相色譜中水的流動相中占的比例伸縮性很大，可以／從0-100％，從而使反相色譜可用于水溶性、脂溶性化合物的分離。反相色譜法中的固定相是被共價結合到硅膠載體上的直鏈飽和和烷烴，其鏈的長短不同，最長的是十八烷基，這也是使用得最多的固定相。直鏈飽和烷烴疏水特性隨著碳氫鏈的長度而增加，在反相色譜柱中溶質由于疏水作用而滯留的時間也將隨著碳氫鏈的長度而增加。在一般情況下這意味著用碳氫鏈長的反相色譜柱能得到較好的分辯率，在多數情況下是依靠反復來選擇色譜柱。由于反相色譜法的固定相是疏水的碳氫化合物，溶質與固定相之間的作用主要是非極性相互作用，或者說疏水相互作用，因此溶劑的強度隨著極性降低而增加。水是極性最強的溶劑，也是反相色譜中最弱的溶劑。在反相色譜中常常用和基礎溶劑，向其中加入不同濃度的、可以與水混溶的有機溶劑，以得到不同強度的流動相，這些有機溶劑稱為修飾劑。反相色譜中最常用的有機溶劑有甲醇和乙腈，此外，乙醇、四氫呋喃、異丙醇及二氧六環也常被用作修飾劑。 在生化分析中，反相色譜的應用極廣?？捎糜冖侔被岷投嚯牡姆治?；②蛋白質的分離；③堿基，核酸和核酸酶的分析；④甾體化合物的分析；⑤以及其他如幾茶酚胺類，組胺，糖及維生素的分離。 （三）離子交換色譜 離子交換色譜中的固定相是一些帶電荷的基團， 這些帶電基團通過靜電相互作用與帶相反電荷的離子結合。如果流動相中存在其他帶相反電荷的離子，按照質量作用定律，這些離子將與結合在固定相上的反離子進行交換。固定相基團帶正電荷的時候，其可交換離子為陰離子，這種離子交換劑為陰離子交換劑；固定相的帶電基團帶負電荷，可用來與流動相交換的離子就是陽離子，這種離子交換劑叫做陽離子交換劑。陰離子交換柱的功能團主要是－NH2，及－MH3+：陽離子交換劑的功能團主要是－SO3H及－COOH。其中-NH3+離子交換柱及-SO3H離子交換劑屬于強離子交換劑，它們在很廣泛的pH范圍內都有離子交換能力；-NH2及-COOH 離子交換柱屬于弱離子交換劑，只有在一定的pH值范圍內，才能有離子交換能力。離子交換色譜主要用于可電離化合物的分離，例如，氨基酸自動分析儀中的色譜柱，多肽的分離、蛋白質的分離，核苷酸、核苷和各種堿基的分離等。 二、易出現的問題 （一）渦流擴散（Eddy diffusion） 流動相碰到較大的固體顆粒，就像流水碰到石頭一樣產生渦流。如果柱裝填得不均勻，有的部分松散或有細溝，則流動相的速度就快；有的部位結塊或裝直緊密則流就慢，多條流路有快有慢，就使區帶變寬。因此，固相載體的顆粒要小而均勻，裝柱要松緊均一，這樣渦流擴散小，柱效率高。 （二）分子擴散（Molecular diffusion） 分子擴散就是物質分子由濃度高的區域向濃度低的區域運動，也稱縱向分子擴散。要減少分子擴散就要采用小而均勻的固相顆粒裝柱。同時在操作時，如果流速太慢，被分離物質停留時間長，則擴散嚴重。 （三）質量轉移（Mass transfer） 被分離物質要在流動相與固定相中平衡，這樣才能形成較窄的區帶。在液相色譜中，溶質分子要在兩個液相之間進行分配，或在固相上被吸附和解吸附均需要一定的時間。當流速快時，轉移速度慢，來不及達到平衡動相就向前移，這各物質的非平衡移動，使區帶變寬。 （四）動相流速 當流速太低時，分子擴散嚴重，特別是在氣相色譜中尤為突出。如將理論塔板高度對流速作圖，理論塔板高度隨流速增加而急速下降，當達到最低值時，流速再加大則質量轉移起主要作用，理論塔板高度又加大。在高效液相色譜中，流速稍快影響不大，但在凝膠過濾色譜中，因為物質要滲透到凝膠內部，所以質量轉移影響大，流速咖大會降低柱效率。 （五）固定相顆粒大小 定相顆粒越小柱效率越高，對流動相流動的阻力越大，需要加大壓力才能使它流動。
